Abstract

BACKGROUND:

In this study, shoots of Aralia elata and Kalopanax pictus which belong to the Araliaceae family were analyzed using UPLC-DAD-ESI(+)-QToF/MS to characterize of individual phenolic acids.

METHODS AND RESULTS:

Total thirteen phenolic acids were identified, and nine hydroxycinnamic acid derivatives have been identified for the first time in shoots of Aralia elata and Kalopanax pictus. For total phenolic acid content (mg/100g dry weight), shoots of Aralia elata and Kalopanax pictus showed 754.8 and 845.3 mg/100g, respectively. 5-O-Caffeoylquinic acid (49%) and 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (44%) were found as major phenolic acids in Aralia elata, while 5-O-caffeoylquinic acid (91%) was a major component in Kalopanax pictus.

CONCLUSION:

On comparing the two plants, it was considered that the biosynthesis of 3,5-di-O-caffeoylquinic acid can be affected by 5-O-caffeoylquinic acid in Aralia elata.

Keyword

Aralia elata,Hydroxycinnamic acid derivatives,Kalopanax pictus,UPLC-DAD-ESI(+)-QToF/MS

서론

페놀화합물은 식물성 이차대사물질 중 가장 큰 범주에 속하며, 여러 과일 및 채소류에서 8,000개 이상의 서로 다른 화합물이 존재한다고 보고되었다(Crozier et al., 2009). 페놀산은 구조에 따라 hydroxycinnamic acid류(C₆-C₃)와 hydroxybenzoic acid류(C₆-C₁)로 구분되며, 이 중 hydroxycinnamic acid류가 더 큰 비중을 차지한다(Mattila et al., 2007). 이들은 효소적 hydroxylation(-OH), O-methylation(-OCH₃), O-glycosylation 등의 결합 패턴에 따라 다양한 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다((Rice-Evans et al., 1997). 식물체에서 가장 흔하게 발견되는 페놀산은 caffeic acid와 ferulic acid이며, caffeic acid 는 주로 quinic acid와 ester 결합된 형태의 hydroxycinnamic acid 유도체로 존재한다(Crozier et al., 2009; Heleno et al., 2015).

두릅나무(Aralia elata)와 음나무(Kalopanax pictus)는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 식물로, 국내에서는 이들의 어린잎을 나물로 식용하고 있다. 두릅나무 순에서 동정된 5-O-caffeoylquinic acid, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid는 산화 방지 및 간세포 보호효과를 나타내는 것으로 보고되었다(Kwon et al., 2018). 두릅나무 순으로부터 분리된 3,4-di-O-caffeoylquinic acid, 3-O-caffeoylquinc acid, 5-O-caffeoylquinic acid는 활성 질소종인 peroxynitrite(ONOO-)의 소거 활성을 나타내었다(Nugroho et al., 2011).

두릅나무과 관목의 수피는 한방에서 주로 약용으로 이용하며 지금까지 이들 추출물의 약리학적 활성을 측정하는 연구가 주로 수행되어 왔다(Hwang et al., 2013; Lee et al., 2001; Oh et al., 2005). 두릅나무 수피에서 분리된 3,4-dihydorxybenzoic acid, 4-hydroxycinnamic acid의 항미생물 효과가 보고되었으며(Ma et al., 1995, 1996), 음나무 수피로부터 분리된 kalopanaxin A, B, F, coniferin, liriodendrin가 간세포에서 항염증 효과를 나타내었다(Quang et al., 2011).

한방에 근거한 두릅나무과 관목 수피의 약리학적 측면에 관한 연구는 꾸준히 진행되어 왔으나 두릅나무 및 음나무 순은 예로부터 식용으로 이용되어 왔음에도 불구하고 페놀산의 분리·동정에 대한 연구는 아직 부족한 실정이며, 특히 이들의 놀산 특성 비교에 대한 연구는 없는 상태이다.

최근 건강에 대한 관심이 증대되면서 안정성이 높은 원료를 이용한 건강보조 식품 개발에 대한 연구가 활발하게 수행되고 있으며(Kim, 2015), 잠재적인 생리활성 기능을 가진 두릅나무 순을 첨가한 다양한 식품 개발 연구들이 수행되었다. 설기떡 제조 시 두릅가루를 첨가하면 설기떡의 저장성이 높아진다고 보고된 바 있으며(Kang et al., 2009), 두릅나무 및 음나무 순 가루를 첨가한 국수가 높은 식이 섬유 함량을 나타내었다고 보고하였다(Kim and Lee, 2012).

이에 본 연구는 UPLC-DAD-ESI(+)-QToF/MS 분석을 통해 국내산 두릅나무 및 음나무 순에 함유된 페놀산을 분리·동정하여 각 식물간의 페놀산 특성을 비교하고, 이들의 건강보조 식품 원료로써 이용 가능성을 평가하고자 하였다.

재료및방법

재료 및 시약

본 실험에 사용한 두릅나무 및 음나무 순은 2016년도에 국내 재배된 것을 시중에서 구입하여 시료로 사용하였다. 각 시료를 흐르는 물에 세척 한 후 물기를 닦은 다음 1-3 cm 길이로 세절하여 –20℃ 냉동고에 보관한 후 동결 건조 하였다. 동결 건조된 각 시료를 분쇄한 후 밀봉하여 분석 전까지 –70℃ 냉동고에 보관하였다.

페놀산 분석에 사용된 3,4-dihydroxybenzoic acid, caffeic acid, 4-O-caffeoylquinic acid, 5-O-caffeoylquinic acid, 및 2,4,5-trimethoxycinnamic acid는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 5-O-Caffeoylquinic acid methyl ester는 Extrasynthese(Genay Cedex, France)에서 구입하여 사용하였으며, 3-O-caffeoylquinic acid, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid 및 4,5-di-O-caffeoylquinic acid 는 Chem Faces(Wuhan, China)에서 구입하여 사용하였다. Water, acetonitrile(ACN) 및 methanol(MeOH)는 UPLC grade(Fisher Scientific Co., USA)를 사용하였으며, formic acid(FA)는 Daejung Chemicals & Metals (Siheung, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

페놀산 추출

동결 건조된 시료 1 g과 내부표준물질인 2,4,5-trimethoxycinnamic acid 250 ppm이 함유된 추출용매(MeOH: water: FA = 80: 15: 5) 10 mL를 혼합하여 30분간 교반 추출한 후 원심분리(3000 rpm, 15 min, 10℃)하였다. 0.45 μm syringe 필터(Whatman International, Maidstone, Kent, UK)를 사용하여 상층액을 여과한 다음, 여과액 0.5 mL을 물 4.5 mL을 합하여 희석시켰다. Sep-pak C18 cartridge(Waters Co., Milford, MA, USA)에 물 2 mL, 물 2 mL 순으로 흘려주어 활성화 시킨 후 희석된 여과액 5 mL을 로딩시켜 페놀화합물을 내부에 고정시켰다. 물 2 mL을 흘려주어 컬럼 내부를 세척한 뒤 메탄올 3 mL을 흘려주어 화합물을 용출한 다음 질소가스로 농축시켜 내부표준물질이 없는 추출용매 0.2 mL로 재용해 하였다. 0.2 μm syringe 필터(Whatman)를 사용하여 재용해액을 여과한 다음, LC-vial에 담아 UPLC-DAD-ESI(+)-QToF/MS를 이용하여 분석하였다.

UPLC-DAD-ESI(+)-QToF/MS를 이용한 페놀산 분리 및 동정

페놀산의 분리 및 동정을 위해 UPLC(Waters, ACQUITY UPLC^TM system, Waters Co., Milford, MA, USA)와 diode array detector(DAD)가 연결된 QToF 질량분석기(Xevo G2 QToF, Waters MS Technologies, Manchester, UK)를 사용하였다. 분석 시 검출 파장 범위는 210-400 nm 이었으며, hydroxybenzoic acid류, hydroxycinnamic acid류의 대표파장은 각각 280, 320 nm로 설정하였다. 페놀산의 분리를 위해 CORTECS® UPLC® VanGuard^TM 보호컬럼(2.1 × 5 mm; Waters Co.)이 부착된 CORTECS® UPLC® T3 컬럼(2.1 × 150 mm, 1.6 μm; Waters Co.)을 사용하였다. 이동상은 A: 0.1% FA in water, B: 0.1% FA in ACN을 사용하였고, 이동상 B를 2%로 시작하여 4분 동안 유지하고, 8분까지 4%, 20분까지 7%, 32분까지 11%, 55분까지 15%, 75분까지 25%, 85분까지 50%로 증가시켰으며, 87분까지 유지하였다. 이어서 90분까지 90%로 증가시킨 후 92분까지 유지하다 95분까지 2%로 감소시켜 100분까지 유지하였다. 유속은 0.35 mL/min, 컬럼 오븐온도는 30℃, 시료 주입량은 1 μL로 설정하였다. 질량 분석기의 이온 검출방식은 positive ion 모드를 사용하였으며, capillary 전압은 3.5 kV, sampling con 전압은 40 V, ion source 온도는 120℃로 설정하였다. Desolvation gas의 온도와 유속은 각각 500℃, 1020 L/hrs로 설정하였으며, 질량 스캔 범위는 m/z 50-1000으로 설정하였다. 페놀산 동정 시 선택성 및 정확성을 높이기 위해 특정 이온의 m/z를 선택하는 selected ion monitoring(SIM) mode를 사용하였고, 선행 연구결과의 UV spectrum, 단편 이온 패턴을 참고하였다. 검출된 성분은 내부표준물질의 면적과 상대적으로 비교하여 정량되었으며, 각 화합물 간 response factor는 고려하지 않았다.

결과및고찰

두릅나무 및 음나무 순 내 페놀산 구조 동정

선행 연구 및 표준품의 검출 시간, UV, MS 데이터를 이용하여 국내산 두릅나무 및 음나무 순으로부터 총 1종의 hydroxybenzoic acid 유도체와 12종의 hydroxycinnamic acid 유도체가 동정되었다(Fig. 1, Table 1). UPLC-DAD-ESI(+)-QToF/MS 분석 결과 3,4-dihydroxybenzoic acid(m/z 155, peak 1), caffeic acid(m/z 181, peak 3)를 제외한 모든 페놀산 성분들에서 모분자에 Na⁺(23 Da) 또는 K⁺(39 Da)가 결합된 단편이온 패턴이 관찰되었다.

Peak 1의 최대 흡광파장은 293 nm로 관찰되었으며, m/z 155[M+H]⁺, 137[M+H-H₂O]⁺의 단편이온 패턴이 관찰되어 dihydroxybenzoic acid isomer로 추정되었다. 표준품를 사용하여 peak 1을 분석한 결과 3,4-dihydroxybenzoic acid 임을 확인하였으며, 또한 선행 연구에서 두릅나무 및 음나무 수피에서 3,4-dihydroxybenzoic acid가 보고된 바 있으나(Ma et al., 1995; Sano et al., 1991), 이들의 순에서는 미량이지만 처음으로 확인되었다.

Peak 3의 모분자는 m/z 181로 확인되었고, caffeic acid(Caf)의 단편이온 패턴인 m/z 163[Caf+H-H₂O]⁺, 135[Caf+H-H₂O-CO]⁺가 관찰되어 표준품을 이용하여 분석한 결과 caffeic acid임을 확인하였으며, 두릅나무 및 음나무 순에서 모두 처음으로 동정되었다.

Peak 2, 4, 5의 최대 흡광파장은 325 nm 부근이었으며, m/z 355를 모분자로 관찰되었다. 또한 m/z 181[Caf+H]⁺, 163[Caf+H-H₂O]⁺, 145[Caf+H-2H₂O]⁺이 나타나 이들은 모두 caffeoylquinic acid isomer로 추정되었다(Fig. 2). 표준품의 검출시간, UV, MS 데이터와 비교한 결과 peak 2, 4, 5는 각각 3-O-caffeoylquinic acid, 5-O-caffeoylquinic acid, 4-O-caffeoylquinic acid로 확인되었다. 3-O-caffeoylquinic acid는 두릅나무 순에서는 처음으로 확인되었고, 5-O-caffeoylquinic acid는 두릅나무 및 음나무 순에서 보고 된 바 있으며(Nugroho et al., 2011; Hu et al., 2012), 4-O-caffeoylquinic acid는 두릅나무 및 음나무 순에서 모두 처음으로 동정되었다.

Peak 6은 310 nm에서 최대 흡광파장을 갖는 것으로 확인되었고, m/z 339를 모분자로 가지는 것으로 확인되었다. 또한, p-coumaric acid (Coum)의 단편이온 패턴인 m/z 147[Coum+H-H₂O]⁺, 119[Coum+H-H₂O-CO]⁺이 관찰되었으며(Fig. 2), 모분자와 p-coumaroyl기 사이의 분자량 차이를 고려하여 p-coumaroylquinic acid isomer로 추정되었다. 페놀산 분석 시, 역상 컬럼을 사용하면 caffeoylquinic acid isomer들의 검출 순서와 유사하게 p-coumaroylquinic acid isomer 또한 일정한 검출 순서를 가지는 것으로 알려져 있다(Viacava et al., 2017). 마테 잎에서 3-O-p-coumaroylquinic acid, 5-O-p-coumaroylquinic acid, 4-O-p-coumaroylquinic acid 순으로 검출됨을 보고하였으며, 또한 5-O-p-coumaroylquinic acid와 5-O-feruloylquinic acid가 근접한 검출 시간을 갖는 것으로 확인되어(Jaiswal et al., 2010) 본 연구에서도 이와 유사한 경향을 확인하였다. 선행 연구 결과의 검출순서를 토대로 peak 6은 최종적으로 5-O-p-coumaroylquinic acid로 추정되었으며, 국내산 음나무 순에서 3-O-p-coumaroylquinic acid가 보고된 바 있으나(Nugroho et al., 2011) 정확한 구조 동정을 위한 추가 연구가 요구된다.

Peak 7, 8은 selected ion monitoring(SIM) mode에서 모두 m/z 369[M+H]⁺를 가진 isomer로 확인되었다. Peak 7에서는 ferulic acid(Fr)의 단편이온 패턴인 m/z 177 [Fr+H-H₂O]⁺, 149[Fr+H-H₂O-CO]⁺, 145[Fr+H-H₂O-CH₃OH]⁺, 134 [Fr+H-H₂O-CH₃]⁺가 확인되었으나, peak 8에서는 caffeic acid의 m/z 163[Caf+H-H₂O]⁺, 145[Caf+H-2H₂O]⁺가 관찰되었다(Fig. 2, 3). 커피 및 고구마에서 3종의 feruloylquinic acid isomer가 보고된 바 있어(Clifford et al., 2006; Zheng et al., 2008) 실제 커피 및 고구마 시료와 비교한 결과 peak 7은 5-O-feruloylquinic acid로 추정되었으며, peak 8은 표준품의 분석 결과를 토대로 5-O-caffeoylquinic acid methyl ester로 확인되었고, 이들은 모두 두릅나무 및 음나무 순에서 처음 동정되었다.

Peak 9, 10은 모두 326 nm 부근에서 최대 흡광파장을 나타냈으며, 모분자로 m/z 517을 가지면서 m/z 181[Caf+H]⁺, 163[Caf-H₂O]⁺의 단편이온 패턴이 확인되어 dicaffeoylquinic acid isomer로 추정되었다. 표준품의 UV, MS 데이터와 비교해 본 결과 peak 9, 10은 각각 3,5-di-O-caffeoylquinic acid, 4,5-di-O-caffeoylquinic acid로 동정되었으며, 그 중 4,5-di-O-caffeoylquinic acid는 음나무 순에서는 검출되지 않았고, 두릅나무 순에서는 처음 확인되었다.

Peak 11-13은 오직 두릅나무 순에서만 확인되었으며, SIM 모드를 활용하여 분석한 결과 공통적으로 m/z 531 [M+H]⁺, 513[M+H-H₂O]⁺, 163[Caf-H₂O]⁺의 단편이온 패턴이 검출되었다. 따라서 이들은 모두 모분자가 m/z 531이면서 caffeoyl기를 가지는 isomer인 것으로 추정되었다. 이 중 peak 11, 12는 단편이온 패턴에서 ferulic acid에서 H₂O가 소실된 m/z 177이 관찰되어 caffeoylferuloylquinic acid isomer로 추정되었다(Fig. 4). 커피 및 고구마로부터 총 6종의 caffeoylferuloylquinic acid isomer(3-O-feruloyl-4-O-caffeoylquinic acid, 3-O-caffeoyl-4-O-feruloylquinic acid, 3-O-feruloyl-5-O-caffeoylquinic acid, 3-O-caffeoyl-5-O-feruloylquinic acid, 4-O-feruloyl-5-O-caffeoylquinic acid, 4-O-caffeoyl-5-O-feruloylquinic acid)가 보고된 바 있으며 (Clifford et al., 2006; Zheng et al., 2008), 실제 커피 및 고구마 시료 분석을 통해 확인된 이들 isomer의 UV, MS 데이터에 근거하여 peak 11, 12는 각각 3-O-feruloyl-5-O-caffeoylquinic acid, 3-O-caffeoyl-5-O-feruloylquinic acid로 최초 추정되었다. Peak 13은 UV와 단편이온 패턴을 토대로 dicaffeoylquinic acid methyl ester로 추정되었으며, 음나무 잎에서 3,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester가 보고된 바 있으나(Hu et al., 2012), 정확한 구조 확인을 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

두릅나무 및 음나무 순 내 페놀산 함량 비교

국내산 두릅나무 및 음나무 순 내 개별 페놀산 함량(mg/100g dry weight)을 내부표준물질을 이용, 정량하여 비교하였다(Table 1). 총 페놀산 함량은 두릅나무 순 754.8 mg/100g, 음나무 순 845.3 mg/100g으로, 음나무 순이 약 11% 높은 함량을 나타내였다.

Caffeic acid는 식물체에서 가장 흔하게 발견되는 페놀산 중 하나이지만 두릅나무 및 음나무 순에서 모두 처음으로 확인되었으며, 음나무 순(5.3 mg/100g)이 두릅나무 순(2.4 mg/100g)에 비해 약 2.2배 높은 함량을 나타내었다.

Hydroxycinnamic acid 유도체는 caffeic acid와 quinic acid가 ester 결합한 형태의 화합물이 다양한 식물 내에서 발현 빈도가 높으며, 하위 그룹으로는 caffeyolquinic acid류, p-coumaroylquinic acid류, feruloylquinic acid류 등을 포함한다(Clifford et al., 2017). 동정된 3종의 caffeoylquinic acid isomer 중 5-O-caffeoylquinic acid의 함량은 음나무 순에서 772.7 mg/100g, 두릅나무 순은 372.7 mg/100g로 각각 총 페놀산 함량 중 약 91%, 49%를 차지하여 두 식물 모두에서 주성분으로 확인되었으며, 국내산 음나무 순에서 5-O-caffeoylquinic acid가 총 페놀산 중 51%를 차지한다고 보고된 바 있으나(Nugroho et al., 2011), 본 연구 결과에 비해 비교적 낮은 함량 비율을 나타내었다. 3-O-caffeoylquinic acid는 두릅나무 순에서 3.5 mg/100g로 관찰되었으나 음나무 순에서는 검출되지 않았고, 4-O-caffeoylquinic acid는 두릅나무 및 음나무 순에서 각각 3.8, 3.1 mg/100g로 두 식물이 유사한 함량을 나타내었다.

두릅나무과 식물 내 3,5-di-O-caffeoylquinic acid는 강한 항산화능과 잠재적으로 세포의 손상을 억제하는 것으로 보고되었으며(Hu et al., 2012), 간세포에서 산화적 스트레스와 지방질 축적 억제 효과가 보고된 바 있다(Kwon et al., 2018). 3,5-di-O-caffeoylquinic acid는 두릅나무 순에서 331.1 mg/100g로 총 함량중 약 44%를 차지하여 위와 비슷한 약리학적 효능을 가질 것으로 기대되는 반면 음나무 순에서는 25.5 mg/100g로 총 함량 중 약 3%만을 차지하는 것으로 관찰되었다. 4,5-di-O-caffeoylquinic acid는 오직 두릅나무 순에서 5.6 mg/100g을 함유하는 것으로 나타났다. Caffeoylquinic acid류는 효소적 생합성 경로에 의해 dicaffeoylquinic acid류를 합성하는 것으로 알려져 있어(Menin et al., 2010), 이들의 함량 차이를 통해 두릅나무 순에서 dicaffeoylquinic acid류 생합성이 활발하게 이루어졌을 것으로 판단된다.

5-O-p-Coumaroylquinic acid의 함량은 두릅나무 및 음나무 순에서 각각 16.8, 13.0 mg/100g로 관찰되었다. 5-O-Feruloylquinic acid 및 5-O-caffeoylquinic acid methyl ester의 함량은 음나무 순이 두릅나무 순보다 약 2.3배 높은 함량을 나타내었다. 오직 두릅나무 순에서만 확인된 3-O-feruloyl-5-O-caffeoylquinic acid, 3-O-caffeoyl-5-O-feruloylquinic acid 및 dicaffeoylquinic acid methyl ester isomer의 함량은 각각 2.6, 3.3 및 0.9 mg/100g로, 총 페놀산 함량 중 0.01-0.04% 범위로 관찰되어 비교적 낮은 함량을 나타내었다.

Hydroxycinnamic acid 유도체는 항산화(Sato et al., 2011), 항염증(Liang et al., 2015), 항고혈압(Zhao et al., 2012), 항종양(Jin et al., 2005)등의 다양한 생리활성 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구 결과를 토대로 식용으로만 사용되어 왔던 두릅나무 및 음나무 순이 건강 보조식품 개발 원료로써 활용 가치가 높아질 것으로 사료된다.

Note

The authors declare no conflict of interest.

ACKNOWLEDGEMENT

This study was carried out with the support of Rural Development Administration (Project No. PJ01265801), Republic of Korea.

Tables & Figures

Fig 1.

UPLC-DAD chromatograms of phenolic acids in Aralia elata (A) and Kalopanax pictus (B). 3,4-dihydroxybenzoic acid (protocatechuic acid, peak 1) and hydroxycinnamic acid derivatives were showed at 280, 320 nm, respectively. 2,4,5-trimethoxycinnamic acid was used as internal standard (ISTD). Data for the numbered peaks are given in Table 1.

Table 1.

Characterization of 13 phenolic acids in the shoots of Aralia elata and Kalopanax pictus using UPLC-DAD-ESI(+)-QToF/MS

Fig. 2.

Proposed fragmentation patterns for 5-O-p-coumaroylquinic acid (m/z 339), 5-O-caffeoylquinic acid (m/z 355) and 5-O-feruloylquinic acid (m/z 368). Coum, p-coumaroyl acid; Caf, caffeic acid; Fr, ferulic acid.

Fig. 3.

Comparison of SIM chromatograms in two tentatively identified isomeric compounds ([M+H]⁺ m/z 369), 5-O-feruloylquinic acid (peak 7) and 5-O-caffeoylquinic acid methyl ester (peak 8) detected in the shoot of Aralia elata and Kalopanax pictus (A) m/z 369, (B) m/z 177, (C) m/z 163, (D) m/z 149, (E) m/z 145, (F) m/z 134.

Fig. 4.

Comparison of SIM chromatograms in three tentatively identified isomeric compounds ([M+H]⁺ m/z 531), 3-O-feruloyl-5-O-caffeoylquinic acid (peak 11), 3-O-caffeoyl-5-O-feruloylquinic acid (peak 12) and dicaffeoylquinic acid methyl ester isomer (peak 13) detected in the shoot of Aralia elata. (A) m/z 531, (B) m/z 513, (C) m/z 177, (D) m/z 163.

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