Abstract

BACKGROUND:

The current study developed a monitoring method of 6 veterinary antibiotics (amoxicillin, ampicillin, enrofloxacin, tetracycline, chlortetracycline, oxytetracycline) in agricultural soils using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in positive electrospray ionization mode.

METHODS AND RESULTS:

Sample preparation was carried out using acidic acetonitrile and citrate salts followed by purification with dispersive solid phase extraction (d-SPE). Separation on Eclipse Plus C₁₈ column was conducted in gradient of the mobile phase, 0.1% formic acid and 5 mM ammonium formate in methanol (A) and 0.1% formic acid and 5 mM ammonium formate in distilled water (B). The linearity of the matrix-matched calibrations expressed as the coefficient of determination was good with R²≥0.9900. The limit of quantifications (LOQs) ranged from 0.5 to 10 μg/kg for all analytes. Analysis of 51 agricultural soil samples taken in the Republic of Korea revealed concentrations less than 1.9 μg/kg for enrofloxacin, 75.5 μg/kg for chlortetracycline.

CONCLUSION:

The method was successfully applied to monitor 6 veterinary antibiotics from 51 field incurred agricultural soil samples in 17 provincial areas throughout the Republic of Korea. The developed method was simple, easy, and versatile and can be used for monitoring various veterinary antibiotics in soil.

Keyword

Agricultural soil,LC-MS/MS,Monitoring,Veterinary antibiotics

서론

가축용 항생제는 병을 치료 또는 예방하기 위해 사용되며 가축의 사료에 혼합함으로써 성장촉진제로 사용되기도 한다. 이러한 목적으로 가축에 투여 된 항생제의 대부분은 소변과 대변으로 배출되어 (Arikan et al., 2009) 높은 잔류농도를 보이는 것으로 알려져 있다 (Broekaert et al., 2011). 특히 가축에 투여된 penicillin계와 tetracycline계 항생제는 각각 30-60%와 70-80%가 배출되는 것으로 보고되었다 (Seo et al., 2007). 고농도의 항생제가 함유된 가축분뇨를 사용하여 오염된 토양에서 작물을 재배할 경우 작물에 흡수 이행되어 작물에 잔류할 뿐만 아니라 작물 성장에 영향을 준다는 연구결과도 있었다 (Broekaert et al., 2012; Ahmed et al., 2015). 또한 토양 외의 환경에서 잔류하는 항생제도 내성균을 생성하여 인간과 가축에게 피해를 줄 수 있다 (Son et al., 2008).

최근 들어 가축용 항생제는 농경지, 퇴·액비, 수질 등에서 다양한 연구가 진행되고 있다(Choi et al., 2008; Lim et al., 2009; Lee et al., 2010; Ok et al., 2011; Kim et al., 2012; Lim et al., 2014). Ok 등(2011)은 물, 퇴적물과 토양 시료에서 가축용 항생제 7종 (chlortetracycline, oxytetracycline, tetracycline, sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulfathiazole, tylosin)을 고상추출법을 이용하여 LC-MS/MS로 분석하였으며 Charm Ⅱ 항생제 조사방법을 사용하여 퇴비에서 tetracyclines, sulfonamides, macrolides를 모니터링하였다 (Kwon et al., 2011). 토양 중 florfenicol과 대사산물 (florfenicol amines)을 분석하기 위한 original QuEChERS 추출법과 LC-MS/MS를 이용한 연구결과도 있다 (Xu et al., 2015). 그러나 토양 중 가축용 항생제 6종 tetracycline계 (chlortetracycline, oxytetracycline, tetracycline), penicillin계 (amoxicillin, ampicillin), fluoroquinolone (enrofloxacin) (Fig. 1)를 EN-QuEChERS 방법을 사용하여 LC-MS/MS로 정량한 분석법은 없으며 현재까지 전국적으로 농경지 토양에서의 모니터링 연구는 아직 발표된 결과가 없어 본 연구에서는 국내 농경지 토양 중 가축용 항생제 6종을 선정하여 모니터링을 실시하여 이에 대한 잔류수준을 평가하였다. 결과를 통해 토양에 잔류된 항생제의 실태를 파악함으로 항생제 오염을 줄이기 위한 관리방안 마련의 기초자료로 사용하고자 한다.

재료및방법

시약 및 재료

표준물질로 amoxicillin (AM, 90.0%), ampicillin (AP, 95.0%), enrofloxacin (ER, 98.0%), chlortetracycline hydrochloride (CTC, 93.1%), oxytetracycline hydrochloride (OTC, 95.0%), tetracycline (TC, 98.0%) 등은 Sigma- Aldrich (MO, USA)에서 구입하였다. HPLC 급의 아세토니트릴과 메탄올, 증류수는 SK chemical(울산, 대한민국)에서 구입하였고 아세트산 (acetic acid, HAc), 개미산(formic acid, FA), 포름산 암모늄(ammonium formate, AF), sodium citrate dibasic sesquihydrate (Na₂Cit.5H₂O, 99.0%)는 Sigma-Aldrich (MO, USA)사 제품을 구매하였고 soidum citrate tribasic dihydrate (Na₃Cit.2H₂O, 99.0%), disodium dihydrogen ethylene-diaminetetraacetate dihydrate (Na₂-EDTA, 99.5%)는 Junsei Chemical Co. Ltd. (Kyoto, Japan) 제품을 사용하였다.

표준용액

CTC를 제외한 모든 표준물질은 메탄올에 용해하여 1000 μg/mL의 표준원액을 만들었고 CTC는 증류수에 용해하여 1000 μg/mL을 제조하였다. 각각 같은 용매로 희석하여 50 μg/mL의 중간표준용액을 만든 뒤 최저정량수준(the lowest calibrated level, LCL)의 500배의 혼합 표준용액을 만들어 사용하였다. 혼합 표준용액을 무처리 토양시료 추출물로 LCL×1, ×2, ×4, ×10, ×20, ×100 수준으로 희석하여 matrix-matched 검량곡선을 작성하였다. 모든 표준원액은 갈색병에 넣어 -20℃ 냉동보관하고 표준용액은 4℃ 냉장보관 하였다.

토양 채취

국내의 서로 다른 17개의 시군에서 농경지 토양으로부터 0-15 cm 표토층을 채취하였다. 채취한 토양은 그늘에서 48시간 풍건하고 막자사발로 파쇄하여 2 mm 체에 통과시켜 시료로 사용하였다. 제조된 시료는 -20℃ 에서 냉동 보관하였다. 채취한 토양의 물리화학적 특징은 Table 1에 자세히 정리하였다.

시료추출 및 정제

토양시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 넣은 후 증류수 5 mL을 첨가한 뒤 30초간 볼텍싱한 후 10분간 방치한다. 아세트산 함유(1%) 아세토니트릴을 10 mL 넣은 후 1 g Na₂Cit.5H₂O, 0.5 g Na₃Cit.2H₂O, 0.1 g Na₂-EDTA를 넣은 뒤 10분간 초음파추출을 한 뒤 원심분리(4,000 rpm, 5 min, 5℃)하였다. 정제를 위해 상층액 6.5 mL를 취하여 C₁₈ 0.5 g을 넣은 후 1분간 볼텍싱 후 원심분리(4,000 rpm, 5 min, 5℃)하였다. 분석법의 감도를 높이기 위하여 원심분리 후 상층액 5 mL을 취하여 질소농축 하여 완전 건고시켜 0.1% 개미산 함유 메탄올/물 혼합액(50/50, v/v) 1 mL로 용해하고 syringe filter(PTFE-hydrophilic, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 사용하였다.

분석조건 설정

Amoxicillin과 ampicillin, chlortetracycline, enrofloxacin, oxytetracycline, tetracycline 총 6성분의 항생제는 Waters Alliance 2695 Separations Module의 LC와 Waters TQ detector API tandem quadrupole mass spectrometer (Waters, MA, USA)의 MS/MS를 사용하였다. 분석에 사용된 컬럼은 Eclipse C₁₈(3.0 mm i.d.×150 mm, 3.5 μm, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)이고, 컬럼 온도는 35℃, 유속은 0.3 mL/min, 주입량은 5 μL이었다. 화합물의 peak 모양과 intensity를 최상의 조건으로 만들기 위해 gradient mode를 사용하였고 Table 2에 자세히 정리하였다.

모든 항생제는 electrospray ionization (ESI) mode의 positive mode에서 이온화되었고, multiple reaction monitoring (MRM) mode 조건을 확립하였다. MS/MS의 조건 precursor ion 및 product ion mass, collision energy(CE)와 cone voltage(CV), capillary voltage(CP)는 Table 3에 정리하였다.

분석법의 검증

분석법을 검증하기 위해 European Commission Decision 2002/657/EC을 참고하여 최저정량수준 (LCL), matrix effect (ME), 직선성, 검출한계 (LOD), 정량한계 (LOQ), 회수율을 통한 정확성(accuracy)과 정밀성(precision) 등을 조사하였다. 최저정량수준 (LCL)은 기기상 정량이 가능한 최저농도를 matrix-matched 표준용액으로 선택하였다. Matrix effect (ME, %)는 LC-MS/MS는 시료에 따라 ME의 영향을 많이 받기 때문에 정량 시 matrix-matched 검량곡선으로 정량을 하여야 한다. 다음 식을 이용하여 ME(%)를 구하였다 (Lee et al., 2011).

Matrix effect (%) = (slope of matrix-matched calibration curve/slope of non-matrix matched calibration curve)×100

직선성을 확인하기 위해 각 항생제의 peak 면적으로 검량곡선(LOQ×1-LOQ×100)을 작성하였고 결정계수 (coefficient of determination, R²)으로 평가하였다. 회수율은 토양 무처리 시료에 각 항생제 표준용액을 첨가한 후 분석하여 실험하였다. 두 처리구(4×LOQ, 10×LOQ)로 수행하였으며 각각의 시료에 3반복으로 수행하여 그에 따른 평균과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 계산하여 분석법의 정확성과 정밀성을 평가하였다. 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)는 크로마토그램의 신호 대 잡음비(signal to noise (S/N) ratio)로 구하였다.

결과및고찰

조사지점 및 동물용의약품 선정

2014년 퇴·액비 판매량 자료를 근거로 전국 총 판매량(2,646,170 톤) 대비 1% 이상인 17개 시·군을 선정하였다(농촌진흥청, 2014년도 가축분뇨 발효액, 가축분퇴비, 퇴비 생산·판매 실적). 1% 이상은 전국을 기준으로 봤을 때 충분히 많다고 가정하였고, 17개 시·군은 전국의 도가 모두 포함되도록 하였다 (Table 4). 강원도 횡성군, 경기도 안성군, 경기도 포천시, 경기도 이천시, 경남 김해시, 경남 산청군, 경남 진주시, 경북 성주군, 경북 의성군, 세종특별자치시, 전남 무안군, 전남 장흥군, 전북 남원시, 전북 정읍시, 충남 예산군, 충남 홍성군, 충북 괴산군; 서울특별시, 광역시, 제주도 제외)

선정된 지점의 토양 채취는 2015년 10월 12일부터 2015년 10월 23일까지 각 지역에서 3지점씩 총 51개 지점의 토양을 채취하였다.

분석법의 최적화

6종의 항생제의 동시분석법을 확립하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. Ho 등(2012)은 토양과 퇴·액비 중 9종의 항생제(doxycycline, enrolfxacin 등)를 메탄올, 아세토니트릴, Na2-EDTA과 McIlvaine 완충용액을 사용하여 추출 후 HLB 카트리지로 정제하는 동시분석법으로 회수율은 63-121%, 상대표준편차 20%이내로 본 논문의 분석성분에 적용하여 회수율 실험하였으나 화합물이 회수되지 않거나 미량으로 회수되어 적용할 수 없었다 (Ho et al., 2012). 토양시료는 다른 시료와 비교하였을 때 다양한 유기산 및 각종 지질이 많으며 특히 tetracyclines와 fluroquinolones은 킬레이트화합물로 토양시료에서 추출이 어려운 단점을 가지고 있어 Na₂-EDTA를 사용함으로써 킬레이트 효과를 감소시킨다(Hu et al., 2008). Bourdat-Deschamps 등 (2014)은 13종(fluroquinolones, tetracyclines, sulfonamides, macrolide 등)의 의약물질에 대해 환경시료(물, 토양, 가축폐수 등)에서 동시분석 한 논문으로 적은양의 시료로 미량의 아세토니트릴과 아세트산나트륨 및 다양한 염(Na₂-EDTA, MgSO₄, Na₂SO₄)으로 추출한 추출법을 참고하여 Table 5와 같이 다양한 QuEChERS 추출법을 이용하여 비교 분석하였다 (Bourdat-Deschamps et al., 2014).

LC-MS/MS 분석

모든 항생제는 positive mode에서 이온화되어 proton adduct [M+H]⁺ 형태를 보였다. 이동상에 들어간 포름산암모늄 (5 mM)은 화합물의 이온화를 증가시켜주는 역할을 하였으며 모든 화합물의 Peak 머무름 시간은 약 11분 이하에서 검출되었다(Fig. 2).

분석법검증

분석법의 특이성을 평가하기 위해 무처리시료와 무처리시료에 항생제를 첨가한 샘플을 비교하였다. 각 항생제의 머무름 시간에 방해 peak은 나타나지 않았다 (Fig. 2). Table 6에서 볼 수 있듯이 항생제의 ME 범위는 37.2 – 173.4% 이며 amoxicillin, chlortetracycline은 100% 이하로 이온억압(ion suppression)되었으며 나머지 항생제인 ampicillin, tetracycline, oxytetracycline, enrofloxacin은 100% 이상으로 이온상승(ion enhancement)되었다. 정량의 정확성을 높이기 위하여 고가의 동위원소 내부표준물질을 사용하거나 경제적인 방법으로 matrix-matched 검량곡선을 사용하여 정량하는데 본 연구에서는 후자의 방법을 이용하였다 (Salvia et al., 2012). 각 항생제의 직선성은 결정계수(R²)≥0.9900으로 만족할 만한 직선성을 나타내었다. 회수율을 통한 정확성, 정밀성 검증은 무처리 토양시료에 4×LOQ, 10×LOQ 수준으로 항생제를 처리하여 32.1-66.7% 범위를 보였으며 상대표준편차는 5.82% 이하이었다. 계열이 다른 항생제를 동시분석법으로 분석하였고 내부표준물질을 사용하지 않아 추출과정에서의 회수율 손실을 보정하지 못하여 각 화합물의 회수율은 낮았지만 정량적인 측면에서 감도가 좋다고 판단되어 (정량한계 및 검출한계 0.15-3, 0.5-10 μg/kg) 모니터링을 위한 간편한 동시분석법으로 제시할 수 있었다. 농경지 토양에서 대상항생제를 분석하기에 충분히 높은 감도라고 판단되었다.

토양 시료 중 항생제 모니터링

검증 한 분석법으로 국내 17지역에서 채취한 총 51지점의 농경지 토양에서 항생제를 모니터링 한 결과 Table 7과 같다. European Commission Decision 2002/657/EC 기준에 의해 matrix-matched 표준용액과 검출된 실제시료를 비교하였을 때 peak 머무름 시간과 정량, 정성이온이 일치하면 검출되었다고 판단하여 정량하였다. 총 6개의 항생제 중 chlortetracycline과 enrofloxacin 등 2개의 항생제가 검출되었다. chlortetracycline의 잔류량과 검출빈도는 각각 65.4-75.5 μg/kg과 7.8% 이었고 enrofloxacin은 0.5-1.9 μg/kg과 9.8% 이었다 (Table 7).

Chlortetracycline, enrofloxacin 항생제가 검출된‘정읍’에서 토양 채취 시 악취가 심했던 걸로 보아 발효가 완전히 되지 않은 퇴비, 액비, 혹은 가축분을 살포한지 며칠 되지 않은 걸로 추측되어 잔류량이 다른 토양과 비교했을 때 높은걸로 추정되었다. Carlson과 Mabury(2003)은 토양 중에 chlortetracycline 1 ppm 수준으로 4주에서 4달 동안 보관한 결과 농도의 변화가 거의 없는 것으로 볼 때 분해가 미미함을 알 수 있었으며 반감기 역시 다른 화합물과 비교하였을 때 13-36일 까지 느리게 분해 된 것으로 확인하였다.

ACKNOWLEDGEMENT

This study was supported by the MSIP (Ministry of Science, Ict and Future Planning) and the Rural Development Administration (Grant No. PJ011435).

Tables & Figures

Fig. 1.

Chemical structure of the tested veterinary antibiotics.

Table 1.

Physicochemical properties of the tested sandy loam soils

Table 2.

Analytical HPLC conditions for the veterinary antibiotics

Table 3.

Molecular weight (MW), precursor and product ion masses, cone voltage (CV), capillary voltage (kV), collision energy (CE), and retention time (Rt) of the tested veterinary antibiotics in LC-(ESI)-MS/MS

Table 4.

Selected area based on solid and liquid manure in the Republic of Korea (2014, ton)

Table 5.

The recovery rate of diverse salts used in various “QuEChERS”version the tested veterinary antibiotics in agricultural soil using LC-MS/MS

Fig. 2.

LC-MS/MS chromatograms of the tested veterinary antibiotics in a blank soil sample (a); matrix-matched standard (10 LOQ) (b); the blank soil fortifying the antibiotics at 10 LOQ (c); and the quantitated antibiotics in a soil collected from Jeongeup-3 (d).

Table 6.

Linear range (LR, μg/kg), coefficient of determination (R² ), matrix effect (%), recovery (%), relative standard deviation (RSD, %), lowest calibration level (LCL, μg/L), limit of detection (LOD, μg/kg), and limit of quantitation (LOQ, μg/kg) of the tested veterinary antibiotics in agricultural soil using LC-MS/MS (n=3)

Table 7.

Monitoring results of the veterinary antibiotics in 51 agricultural soils (n=3, μg/kg)

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