Study on Optimization of Cytoplasm Conditions for In Vitro Micronucleus Test Using Chinese Hamster Lung Cells

서 론

유전독성은 시험물질이 유전자 또는 염색체에 미치는 상해작용을 평가하는 시험법이며, 농약의 등록과정에서 필수적으로 수행하는 시험항목으로 잠재적인 발암성 또는 돌연변이 유발물질을 검출하기 위해 수행하는 시험이다(OCED, 2014; Kirkland et al., 2011). 우리나라는 농약 등록단계에서 복귀돌연변이시험, in vitro 염색체이상시험, in vivo 소핵시험의 3가지 시험법으로 유전독성을 평가하고 있다. 특히, 설치류의 혈구세포를 이용하는 in vivo 소핵시험은 의약품규제조화위원회(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use, ICH)에서 권고하는 유전독성 표준조합 중의 한 방법으로 사용되고 있다(ICH, 2011).

독성시험법들은 동물복지 차원에서 전세계적으로 동물을 사용하지 않고 세포나 조직 등을 이용하는 대체시험법의 개발이 매우 활발하게 진행되고 있다(Yamamoto et al., 2005). 이에 따라, 소핵시험도 포유류 배양세포를 이용한 in vitro 소핵시험법(in vitro micronucleus test, vitMNT)이 개발되어, 염색체이상으로 생겨난 염색체의 파편 혹은 딸세포로의 분리에 실패한 온전한 염색체가 다시 핵막으로 싸여 이루어진 소핵(micronucleus, MN)을 관찰하고 그 출현집도를 산출하여 유전독성을 평가하고 있다(OCED, 2017). 유전독성은 염색체의 수적 이상(numerical aberration)과 밀접하게 관련되어 있는데, 다른 유전독성 시험법 중 하나인 염색체이상 시험은 염색체의 수적 이상을 유발하는 물질들 중 DNA와 직접 반응을 하지 않는 물질들을 검출하기가 통상적으로 어려운 반면, vitMN 시험은 구조적 이상에 의한 염색체의 파편으로부터 생성된 MN 뿐 아니라 염색체의 수적 이상으로 생성된 소핵 역시 계수가 가능하여 상대적으로 더 넓은 범위의 유전독성을 검색할 수 있다(Lee et al., 2011).

하지만, 발암물질을 이용해 복귀돌연변이시험과 vitMNT의 표준조합으로 시험한 결과 민감도는 높으나 특이도가 낮게 나타나 포유류 배양세포를 이용한 유전독성시험에서 높은 양성이 관찰되는 문제가 제기되었다(Kirkland et al., 2005; Matthews et al., 2006). 이에 따라 ICH에서는 in vitro 유전독성시험에서 유전자의 수적이상 유발물질 검출의 한계점 등을 해결하기 위하여 2011년 기존 유전독성 가이드라인인 S2B (ICH, 1995)와 S2A (ICH, 1997)를 통합하여 유전독성 시험 및 자료해석 가이드라인(S2(R1))을 개정하여 유전독성 조합시험법, 결과 평가 등에 대한 평가기준을 명확히 제시하는 등 in vitro 유전독성시험법을 이용한 시험결과의 판정의 신뢰도를 높이기 위해 노력하고 있다(ICH, 2011).

소핵시험법 중 Cytokinesis-block micronucleus (CBMN) 방법은 전통적인 소핵 분석방법으로 선행연구로 재현성과 타당성이 검증된 방법이다(Fenech et al., 2006; Lee et al., 2010; Könen-Adıgüzel et al., 2018). CBMN은 최소한 1회 이상 분열한 세포에 대한 소핵 계수로 제한할 수 있어서, 세포가 유전독성물질에 노출될 때 발생하는 소핵의 빈도가 달라질 수 있는 문제를 해결할 수 있다(Kirsch-Volderset al., 2011).

한편, vitMNT은 관찰 단위가 세포인 시험이기 때문에, 세포 준비, 처리, 고정, 퍼짐성, 염색 및 채점과 같은 많은 단계들이 세포막의 무결성 측면에서 중요하다. 더욱이, 소핵은 주요 핵과 독립적인 작은 개체이기 때문에, 부적절한 고정 또는 퍼짐성 절차가 적용되면 쉽게 잃어버릴 수 있다. 본 시험에서는 OECD 시험법 가이드라인 487, in vitro mammalian cell micronucleus test에서 의거하여 Chinese hamster lung (CHL) 세포를 사용하여 CBMN 조건에서 vitMNT 중소핵 계수 단계의 cytoplasm과 그 band의 판별이 용이한 최상의 조건을 선정하고자 하였다. 양성대조물질인 mitomycin C (MMC)와 colchicine (Col)을 이용하여 1) 최종 현탁액인 3차 고정액인 메탄올 중 아세트산 농도 5조건(0%, 1%, 3%, 5%, 25%), 2) 최종 고정액의 처리시간 차이(즉시, 1시간, 4시간, 1일 경과)별로 현탁액을 슬라이드로 적하한 후 육안으로 소핵관찰이 용이한지 살펴보기 위하여 현미경을 이용해 세포질의 퍼짐성과 세포의 터짐성(cell rupture)을 관찰하였다.

재료 및 방법

시약

양성대조물질로는 염색체의 구조적 이상을 유발하는 MMC와 수적이상을 유발하는 Col은 Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 본 실험에서 실험수행의 적합성 검증을 위해 사용되었다. MMC는 멸균 증류수에, Col은 dimethyl sulphoxide (DMSO)에 용해하여 사용하였으며, 음성대조물질은 멸균 증류수를 사용하였다. 그 외의 모든 시약은 Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

세포주 및 세포배양

실험에서 사용된 세포주는 CHL cell로 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로 부터 구매하였으며, 세포는 10% Fetal Bovine Serum, 1% penicillin-streptomycin, 1% L-glutamine가 포함된 MEM (Minimum essential medium)를 모두 Gibco/Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하여 배양하는데 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂조건에서 2~3일 간격으로 계대배양하였으며, 세포의 doubling time은 25시간이었다. 액틴의 polymerizationatin 저해제로 사용되는 cytochalasinB (cyto B)는 Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

시험방법

시험은 OECD TG 487의 vitMNT (OECD, 2016)을 근거로 하였으며, cyto B를 첨가한 CBMN 시험으로 진행하였다. 세포 수는 1×10⁵ cells/plate로 물질처리시간은 3시간(단시간 노출)과 24시간(장기간노출)으로 하였으며, 사용된 cyto B의 농도는 3 μg/ml이다.

실험절차는 다음과 같다. 시험물질 처리 개시로부터 24시간 후 세포를 수거하여 고정액(methanol:acetic acid, 3:1)으로 2회 고정시켰으며 최종적으로 3차 고정액을 처리 후 슬라이드에 적하 한 후 공기건조법으로 세포표본을 만들었다. 10% giemsa 염색액으로 염색 후 현미경(Nikon, Eclipse 80i, Japan)으로 1,000배에서 관찰하였다.

본 시험에서는 세포질의 최적화 조건을 선정하고자 3차 고정액인 최종 고정액을 메탄올 중 acetic acid 농도가 5가지 농도(0%, 1%, 3%, 5%, 25%)가 되도록 조제하여 현탁하였으며, 또한 최종 고정액의 처리시간 차이 별로 4가지 조건(즉시, 1시간, 4시간, 1일 경과)으로 달리하였다.

소핵판정 기준

소핵의 판독은 Fenech (2006)이 제시한 기준에 따라 판정하였다. Cyto B을 처리하지 않은 시험에서는 각 농도군당 2,000개의 단핵세포(mononucleated cell)로부터 소핵을 가진 세포(micronucleated cell, MNC)를 계수하지만, 본 시험에서는 Cyto B을 처리하였기에 단핵세포(mononucleated cell), 이핵세포(binucleatedcell), 다핵세포(multinucleated cell)의 합계가 500개가 될 때까지 세포를 계수하고, 이핵세포가 1000개가 될 때까지 소핵을 계수하여 기록하였다. 결과 해석을 위해 RI (Replicative Index)와 CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation index)를 산출하여 평가하였다.

통계처리 및 판정은 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences, version 18.0)를 이용하였으며, 시험조건 군별 검증을 위해서 one-way ANOVA (analysis of variance)를 실시하고 유의수준 0.05에서 Duncan test로 유의성을 검증하였다. 판정기준은 음성대조군에 비해 3배 이상의 소핵형 성과 통계적인 유의성을 보일 때 양성으로 판정하고 계수하였다(Miller et al., 1995).

결과 및 고찰

세포질의 퍼짐성

MMC와 Col의 세포질 퍼짐성은 아세트산 농도가 5% 이상인 고정액을 사용한 군에서는 MMC (Fig. 1A)와 Col (Fig 1B) 모두 cell의 세포질이 명확하게 구분되지 않았다. 또한 아세트산을 포함하지 않은 고정액 사용군에서는 세포질이 좁고 어두워서 이핵에서 소핵을 계수하기 어려웠지만 아세트산이 1%와 3%인 고정액 사용군에서 세포질이 뚜렷하게 보였고 band가 적절하여 소핵을 관찰하기에 효과적이었다.

고정액으로서의 메탄올은 소수성 및 수소결합을 파괴함으로써 단백질의 소수성 그룹을 노출시켜 물의 3차구조와 용해성을 바꿈으로써 조직 내 물을 치환하여 탈수작용을 하며, 메탄올과 아세트산을 함유하는 고정액은 염색체(chromosome) 구조는 보존되지만 세포질은 거의 용해된다고 보고하였다(Ruzin, 1999). 최종 고정액에서의 아세트산의 농도가 높아질수록 세포질의 팽윤(swelling)이 커져서, 아세트산을 18% 함유한 용액으로 고정된 세포는 세포질이 부분적으로 분산되어서 각각의 세포의 영역이 불명확해지며, 아세트산의 농도가 높아질수록 세포질 확인이 어려운 것을 알 수 있다.

최종 고정액의 처리시간 차이에 따른 세포질 결과를 살펴보면, 적하시간이 1일이 경과한 경우 세포질이 거의 사라져서 보이지 않았으며, 4시간 경과 후 적하한 군에서는 세포질이 매우 흐리게 나타났다. 따라서 세포를 현탁 시킨 후 4시간 이전에 적하하는 것이 좋음을 알 수 있다. 그러나 적하시간을 현탁 후 즉시 또는 1시간후에 시행한 군에서도 고정액의 아세트산 비율이 증가할수록 세포질은 점점 더 흐려 세포질 중소핵의 관찰이 더 어려웠다.

세포 터짐성

vitMNT는 간기(interphase) 세포 1,000개 중 소핵을 정확하고 신속하게 계수하여야 하므로 최종 단계까지 세포가 터지지 않고 세포질의 형태를 유지하는 것이 중요하다(Yamamoto et al., 2005). 따라서 본 연구에서는 최종 고정액 중 acetic acid 농도별, 최종 고정액의 처리 시간별로 1,000개의 세포 중 터진 세포의 수를 계수하였으며, 양성대조군인 MMC와 Col를 단시간(3시간) 처리한 경우와 장시간(24시간) 처리한 경우로 구분하였다(Fig. 2).

MMC을 단시간 처리군은 고정액을 즉시 처리한 경우 고정액 중 acetic acid의 농도가 0%, 1%, 3%인 경우 세포의 터짐성이 세포 1,000개 당 각각 8.1개, 8.3개, 14.4개로 나타났으며, 고정액 중 acetic acid의 농도가 0과 1%인 경우 고정액을 1시간 처리한 경우 각각 1.2개와 4.0개로 51.9%와 48.3%로 터짐성이 유의적으로 감소하였으나 acetic acid의 농도가 3%인 경우 유의적인 감소는 나타나지 않았다. MMC를 장시간 처리한 경우 고정액 중 acetic acid의 농도가 0%와 3%인 군에서 고정액 처리시간이 증가할수록 세포의 터짐성은 증가하였으나, 1% acetic acid을 함유한 고정액을 처리한 군에서는 고정액 처리 후 즉시 적하한 군(22.4개)에 비해 고정액 처리를 1시간, 4시간, 1일 처리한 경우 터짐성이 각각 14.2개, 16.3개, 15.4개로 즉시 적하한 군에 비해 터짐성이 63.4%, 72.8%, 68.8%로 유의적으로 감소하는 경향을 보였다. 즉 MMC와 Col의 2개의 양성대조물질을 단시간 처리한 경우 3% acetic acid를 함유한 고정액을 처리한 군에서 고정액을 즉시 처리한 군에 비해 1시간 이상 처리한 군에서 세포의 터짐성이 감소하였다.

MMC를 장시간 처리한 경우에도 고정액 중 acetic acid의 모든 농도군에서 최종 고정액 처리시간이 길어질수록 세포의 터짐성은 감소하였는데, 특히 acetic acid의 농도가 1%와 3%의 고정액을 처리한 경우는 고정액을 즉시 적하한 군에서 세포 터짐성이 각각 17.2개와 13.5개였으나 고정액을 1시간 처리한 경우 터짐성이 13.2개와 7.1개로 76.7%와 52.6%로 세포 터짐성이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05). 반면, 장시간 Col을 처리한 군에서는 고정액 중 acetic acid의 농도나 고정액 처리시간에 따른 터짐성의 변화가 유의적인 차이를 보이지 않았다(p<0.05). 본 시험에서 고정액 처리시간에 따른 세포의 터짐성 차이는 세포가 메탄올에 노출되는 시간이 늘어날수록 세포의 조직이 단단해지기 때문인 것으로 생각된다(Ruzin, 1999). 따라서 세포의 터짐성을 낮추기 위해서는 최종 고정액 중 acetic acid 농도가 1%인 고정액으로, 처리시간은 1시간에서 4시간 이내로 처리하는 것이 가장 적절한 것으로 사료된다.

소핵발생률

vitMNT는 해당 시험조건에서 양성대조물질의 소핵유발률이 음성대조군에 비해 유의적으로 높은 수준으로 historical range에 드는지에 대한 신뢰성이 검증되어야 한다. 따라서, CHL 세포에 음성대조군과 양성대조군을 단기간 및 장기간 처리한 vitMN시험에서 세포질의 최적화 조건으로 제안된 시험조건인 1) 1% acetic acid의 최종 고정액 사용, 2) 고정액 처리시간 1시간으로 수행했을 때의 소핵의 발생률을 조사하였다(Table 1).

MMC과 Col을 단시간 처리시 소핵발생률은 각각 4.0%과 4.3%였으며, 장기간 처리시 각각 4.1%과 9.2%로 나타났으며, 이는 음성대조군에 비해 유의적으로 증가한 경향을 보였다. 또한 Cyto B 처리했을 때 시험의 타당성을 확인하는 RI는 음성대조군 대비 양성대조군의 500개 이상의 단핵, 이핵, 다핵세포의 수로부터 산출하게 되는데, 본 시험에서 양성 대조물질의 단기간 및 장기간 처리한 군에서 67~82%로 나타내어, RI 값의 감소 경향이 일관성을 나타내어 본 시험에서 사용된 방법의 신뢰도가 높음을 알 수 있었다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때, vitMNT의 소핵 계수를 위한 신속성 및 용이성, 정확성을 확보하기 위해서는 고정액에 포함된 acetic acid의 함량은 1%로, 고정액 처리시간을 1시간에서 4시간 이내로 하는 것이 가장 적절할 것으로 생각된다.

2010년 OECD TG 487로 채택되면서 국제 및 국내에서 많은 검증시험을 진행한 바 있는(OECD, 2014; Lee et al., 2011) vitMNT는 세포 독성뿐만 아니라 유전적으로 가능성이 있는 것뿐만 아니라 채점, 정확성, 다양한 세포 유형에서의 광범위한 적용 가능성을 탐지 할 수있는 능력 때문에 유전 독성 시험에 대한 매력적인 도구이다(Parry and Sors 1993; Kirsch-Volders 1997; Kirsch-Volders et al., 2011). 그렇지만 OECD의 Expert Consultation의 논의에서 세포독성의 지표인 Relative Increased in Cell Count (RICC)를 지표로 할 경우 vitMN의 유전독성 물질 검출능이 저하될 우려가 제기되었다(ICH, 2011).

반면, 소핵시험은 단순 원형의 소핵을 평가하고 이론적으로 평가에 사용하는 세포의 수에 제한이 없으므로, 평가에 사용한 표본 수를 크게 하여 판독 시 분별력을 높이면 시험의 민감도(sensitivity)를 향상시키고 평가자의 주관이 배제되어 더욱 객관성 있는 결과를 얻을 수 있는 장점을 가지고 있어(Lee et al., 2011), 본 연구와 같이 판독 시 분별력을 높일 수 있는 최적화 연구가 vitMNT를 통해 얻은 시험결과의 정확도 향상에 도움이 될 것으로 생각된다.

ACKNOWLEDGEMENT

This study was carried out with the support of "Research Program for Agricultural Science & Technology Development (Project No. PJ01092304)", National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, Republic of Korea.

Tables & Figures

Fig. 1. Effect of acetic acid concentration in third fixative solution and fixative treatment time on the spread of cytoplasm of Chinese hamster lung cell treated with mitomycin C (A) and colchicine (B) for 3 hours.

Fig. 2. Effect of acetic acid concentration in third fixative solution and fixative treatment time on the ruptured cells per 1,000 cells of Chinese hamster lung cell treated with mitomycin C (MMC) and colchicine (Col) for short and long time, respectively. a, b, indicate a significantly difference between means by Duncan test at p<0.05.

Table 1. Frequency of micronuclei (MN) in Chinese hamster lung cells with treatment with mitomycin C (MMC) and colchicine (Col) compared to negative controls

^1)
2) %MN, Micronuclei in cells. ksea

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